摘要： "以桦树液和沙棘为原料，筛选出适合桦树液沙棘复合酒酒精发酵的菌种；在此基础上，通过单因素和响应面试验优化桦树液沙棘复合酒的发酵工艺条件。结果表明：最适用于桦树液沙棘复合酒酒精发酵的商业菌种为酿酒酵母DV10；最佳发酵工艺为：酵母菌接种量为0.07%，初始pH值为3.6，发酵温度为25 ℃，SO2添加量为83 mg/L。在此条件下酿制的桦树液沙棘复合酒呈金黄色，具有明显的酒香以及桦树液、沙棘的清香，香味协调，酒体丰满，醇香浓厚，典型性佳，以期为桦树液沙棘复合酒工业化开发以及桦树液和沙棘的综合利用提供一定的理论基础。
关键词： "桦树液； "沙棘； "菌种筛选； "发酵工艺； "响应面法
中图分类号： " S 79; TS 2 " " " " " " " 文献标识码： " A " " " " " " " "文章编号：１００1 － 9499（２０24）04 － 0036 － 07
Optimization of Fermentation Process of Birch Sap and Sea Buckthorn Compound Wine by Response Surface Methodology
QU Wei HAO Diqiu LI Wenjia LI Peishan MENG Zhuoyi PENG Bo JIA Pengbo**
（Jiamusi Branch of Heilongjiang Academy of Forestry Sciences， "Heilongjiang Jiamusi 154000）
Abstract Using birch sap and sea buckthorn as raw materials， the strains suitable for alcoholic fermentation of birch sap and sea buckthorn compound wine were screened. On this basis， single factor and response surface tests were used to optimize the fermentation conditions of birch sap and sea buckthorn compound wine. The results showed that the most suitable commercial strain for alcoholic fermentation of birch sap and sea buckthorn compound wine was saccharomyces cerevisiae DV10. The optimum fermentation conditions were as follows： the inoculated amount of yeast was 0.07%， the initial pH value was 3.6， the fermentation temperature was 25 ℃， and the added amount of SO2 was 83 mg/L. Under these conditions， the birch sap and sea buckthorn compound wine was golden in color， with obvious aroma and fragrance of birch sap and sea buckthorn. The aroma was coordinated， the wine was full-bodied， mellow and good typical. It was expected to provide a certain theoretical basis for the industrial development of birch sap and sea buckthorn compound wine and the comprehensive utilization of birch sap and sea buckthorn.
Key words Birch sap; sea buckthorn; strain screening; fermentation process; response surface methodology
桦树液是从桦树流出的无色或淡黄色的透明液体，带有独特的木质清香味[ 1 ]，桦树液中蕴含着人体所需的各种氨基酸、矿物质、脂肪酸等常见营养成分[ 2 ]，此外，还含有过氧化物酶、过氧化氢酶、桦芽酸、细胞分裂素、香精油和皂角甙化合物等活性成分[ 3 ]。桦树液具有祛痰止咳、促进人体新陈代谢、抗疲劳、增强机体免疫力等作用[ 4 ]。
沙棘是一种胡颓子科沙棘属落叶性灌木，具有较强的适应性，主要分布在我国东北、华北、西北和西南等地区[ 5 ]。其果实富含维生素、黄酮、微量元素、矿物质等营养成分，具有抗衰老、抗氧化、改善肠道菌群、增强免疫力、降血脂等作用[ 6 ]。
桦树液酒酿造过程中存在发酵困难、易氧化、口感平淡的问题；沙棘果由于其过高的酸度，制得果酒口感较酸，且易浑浊[ 7 ]。桦树液与沙棘混合酿酒，能够优势互补，解决单一原料酿酒存在的问题，并且复合酒的颜色稳定、口感较好，但目前国内对桦树液沙棘复合酒酿造工艺鲜有报道。本研究以桦树液、沙棘为主要原料制备桦树液沙棘复合酒。通过试验筛选适用于桦树液沙棘复合酒发酵的商业菌种，并采用单因素和响应面试验优化桦树液沙棘复合酒的发酵工艺，旨在为桦树液沙棘复合酒工业化开发以及桦树液、沙棘的综合利用提供一定的理论基础。
1 材料与方法
1. 1 材料与试剂
桦树液、沙棘果：采自伊春市带岭区东方红林场；白砂糖：天津市鼎盛鑫化工有限公司；壳聚糖（食品级）：广州天佳生物科技有限公司；DV10、EC1118和K1型号酵母菌：上海杰兔工贸有限公司；柠檬酸（分析纯）：长春健鹰食品添加剂公司；氢氧化钠（分析纯）哈尔滨新春化工产品有限公司；偏重亚硫酸钾（分析纯）：天津市大茂化学试剂厂。
1. 2 仪器与设备
ESJ182-4型电子天平：上海拓西电子科技有限公司；PHS-3C型精密PH计：杭州雷磁分析仪器厂；HJ-6磁力搅拌器：天津市滨海新区大港红杉实验设备厂；HWS-70B恒温恒湿箱：青岛明博环保科技有限公司；721紫外可见分光光度计：上海力辰仪器科技有限公司；YXQ-LS-50SⅡ型立式压力蒸汽灭菌锅：上海博迅实业有限公司。
1. 3 试验方法
1. 3. 1 桦树液沙棘复合酒的加工工艺流程
1. 3. 2 操作要点
工艺操作要点
（1）沙棘汁的制备：挑选果实完整、饱满、无霉变的沙棘果，清洗，去梗后，用榨汁机破碎，称量果汁重量后，加入0.8%的果胶酶，在30 ℃下酶解2 h。酶解完成后，将果汁进行过滤，得到沙棘汁。
（2）桦树液的采集：在桦树叶还未长出前，桦树液开始流动时对桦树液进行采集，并对采集的桦树液进行过滤后，待用。
（3）调配：经过前期预实验将桦树液与沙棘的混合比例确定为3∶1。
（4）糖酸度调整：使用蔗糖调节混合汁调节初始糖度为180 g/L，使用柠檬酸钠或碳酸氢钠调节混合汁和酸度。
（5）酒精发酵：在酿酒酵母中加入10倍质量的5%蔗糖溶液后，将其放置在32 ℃下活化20 min，得到酵母菌种子液。将酵母菌种子液接种到桦树液沙棘混合汁中，搅拌均匀后，进行酒精发酵。每隔12 h测一次糖度和比重，糖度和比重不再变化时判断达到发酵终点。
（6）过滤、澄清：将复合酒通过过滤去除果肉和酒脚，静置一段时间，进行澄清处理。
（7）陈酿、灭菌：将果酒置于橡木桶内进行陈酿1个月后，置于80 ℃条件下处理30 min，无菌装瓶，即得桦树液沙棘复合酒成品。
1. 3. 3 酵母菌的筛选
在试验过程中将活化好的DV10、EC1118和K1型号的酵母，按照0.06%的接种量分别接入到桦树液与沙棘果混合汁中，初始pH调至3.6，SO2添加量为90 mg/L，在26 ℃恒温培养箱内进行发酵，以酒精度和感官评价作为复合酒发酵状况的评价指标，选出发酵性能好，复合酒口感佳的酵母。
1. 3. 4 桦树液沙棘复合酒发酵的单因素实验
在试验过程中分别将接种量、pH值、温度和SO2添加量作为自变量，以酒精度和感官评分为评价指标，探究不同的酵母菌接种量、初始pH值、发酵温度和SO2添加量对桦树液沙棘复合酒的影响。
1. 3. 5 桦树液沙棘复合酒发酵工艺优化
在单因素试验的基础上，对接种量、pH值、温度和SO2添加量进行优化（表1），以酒精度和感官评价作为评价指标，从而明确复合酒发酵最佳工艺参数。
表1 响应面试验因素与水平
1. 3. 6 理化指标测定
总糖测定参照张开平[ 8 ]等采用的3，5-二硝基水杨酸（DNS）法；酒精度测定参照GB 5009.225-2016；挥发酸、总二氧化硫和干浸出物的测定参照GB/T 15038-2006。
1. 3. 7 感官评价
选择食品专业10名感官品评人员对桦树液沙棘复合酒进行感官评价，并按照表2桦树液沙棘复合酒的感官评分细则给予相应的分数。
表2 桦树液沙棘复合酒的感官评分细则
1. 3. 8 微生物微指标测定
菌落总数、大肠菌群及沙门氏菌的测定分别参照GB 4789.2-2016、GB 4789.3-2016和GB 29921-
2021项下方法及标准进行测定。
2 结果与分析
2. 1 酵母菌的筛选
由图1可知，随着发酵时间的增加，发酵液内的酒精度数逐渐升高。其中使用酵母菌EC1118发酵用时6 d，最短，桦树液沙棘复合酒的酒精度数达到9.5 %vol；使用酵母菌DV10发酵用时为7 d，桦树液沙棘复合酒的酒精度为9.5 %vol；使用酵母菌K1发酵用时为7 d，桦树液沙棘复合酒的酒精度为9.0 %vol。
2. 1. 1 不同酵母菌对桦树液沙棘复合酒感官品质的影响
不同酵母菌对桦树液沙棘复合酒感官品质的影响如图2所示，使用酵母菌EC1118制备的复合酒酒样呈土黄色，酒味较重，苦涩，入喉有刺激感，感官评分最低；使用酵母菌K1制备的复合酒酒样呈橙黄色，比较澄清，具有淡酒香和桦树液、沙棘的清香，但后味苦涩；使用酵母菌DV10制备的复合酒酒样呈金黄色，澄清度高，香气纯正，具有酒香和桦树液、沙棘的清香，入口绵软醇厚，无苦涩味，感官评分最高。
2. 2 桦树液沙棘复合酒发酵单因素试验结果
2. 2. 1 酵母菌接种量对桦树液醋酸度的影响
由图3可知，随着酵母菌接种量的增加，桦树液沙棘复合酒的酒精度和感官品质均呈现升高的趋势，这是因为酵母菌的产酒精速度随着酵母菌数量的增多而加快。接种量为0.06%时，酒精度和感官评分达到最大值，分别为9.5 %vol和88.2分；当接种量高于0.06%时，酒精度和感官品质均呈现降低的趋势。这可能是酵母菌接种量过大，菌体增长繁殖耗费了桦树液沙棘混合汁中大部分营养，使得酒精发酵相关的底物含量降低，不利于酒精发酵[ 9 ]，并且酵母味过重，导致复合酒的酒精度和感官评分降低。因此，桦树液沙棘复合酒的最适酵母菌接种量为0.06%。
2. 2. 2 初始pH值对桦树液沙棘复合酒品质的影响
由图4可知，随着初始pH的增大，桦树液沙棘复合酒酒精度和感官评分均呈现先升后降低趋势。当初始pH值低于3.6时，不利于酵母菌的生长繁殖，使得复合酒的酒精度较低，酒香不足。当pH值为3.6时，酒精度和感官评分达到最大值，分别为9.5 %vol和87.5分。当pH值高于3.6时，酒精度和感官评分均降低，这主要是因为过高的初始pH值使酵母菌的成长、代谢受到限制[ 10 ]，从而导致了复合酒的酒精度和感官评分下降。因此，桦树液沙棘复合酒的最适初始pH值为3.6。
2. 2. 3 发酵温度对桦树液沙棘复合酒品质的影响
由图5可以看出，随温度升高酒精度及感官评分增大。当温度为26 ℃时，酒精度和感官评分最高，分别为9.5 %vol和87.6分。当温度高于26 ℃时，酒精度和感官评分开始下降，温度过高会导致酵母菌快速繁殖和衰老，并且还会产生不良的发酵味[ 11 ]，从而导致复合酒的酒精度和感官评分降低。因此，最适温度为26 ℃。
2. 2. 4 SO2添加量对桦树液沙棘复合酒品质的影响
由图6可以看出，随着SO2添加量的增加，桦树液沙棘复合酒的酒精度和感官评分呈现先升后降趋势。当SO2添加量低于90 mg/L时，复合酒的酒精度和感官评分较低，这主要是因为SO2添加量过低时，对杂菌的抑菌作用并不完全，干扰了酵母菌的正常生长和代谢过程[ 8 ]，从而降低了复合酒的酒精度和感官评分。当SO2添加量为90 mg/L时达到最大值，分别为9.5 %vol和89.1分。当添加量高于90 mg/L时，抑制酵母菌的活性且硫味较重，使得酒精度和感官评分降低。因此，桦树液沙棘复合酒的最适SO2添加量为90 mg/L。
2. 3 桦树液沙棘复合酒发酵工艺响应面试验结果
响应面试验设计方案及桦树液沙棘复合酒的酒精度和感官评价如表3所示。
利用Design-Expert13.0软件对表5数据进行多元回归拟合，回归方程方程为：
Y1=9.42+0.2A-0.033 3B-0.058 3C-0.225D-
0.225AB-0.075AC-0.1AD+0.05BC+0.075BD+
0.35CD-0.380 8A2-0.530 8B2-0.543 3C2-0.193 3D2
Y2=88.76+1.42A-0.266 7B-0.475C-1.55D-
1.77AB- 0.65AC-0.85AD+0.3BC+0.475BD+
2.38CD-3.16A2-3.93B2-4.24C2-1.75D2
酒精度和感官评分的相关系数R2分别为0.886 8和0.896 6，校正系数R2Adj分别为0.773 5和0.793 2，变异系数C.V.分别为2.54%和1.90%，说明该模型的拟合度、可信度和重现性较好，可以对桦树液沙棘复合酒发酵工艺进行预测和分析。由表5可知，各因素酒精度的影响依次为：SO2添加量（D）gt;酵母菌接种量（A）gt;发酵温度（C）gt;初始pH值（B），其中一次项A、D，交互项CD以及二次项A2、B2和C2对复合酒的酒精度有极显著影响（P＜0.01），二次项D2对复合酒的酒精度有显著影响（P＜0.05）。由图7可知，温度和SO2添加量对复合酒的酒精度影响最为显著。
由表5可知，SO2添加量对感官评分的影响最为显著，其次是接种量，再次是温度，最后是初始pH值。其中一次项A、D，交互项CD以及二次项A2、B2和C2对复合酒的感官评分有极显著影响（P＜0.01），交互项AB和二次项D2对复合酒的感官评分有显著影响（P＜0.05）。由图8可知发酵温度和SO2添加量对桦树液沙棘复合酒的感官评分影响最为显著。
通过软件Design-Expert 13.0分析，酵母菌接种量为0.068%，pH值为3.563，温度为25.372 ℃，SO2添加量为82.691 mg/L时，复合酒酒精度理论值达到最高，为9.607 %vol；接种量为0.068%，pH值为3.603，温度为25.388 ℃，SO2添加量为83.148 mg/L时，复合酒感官评分理论值达到最高为89.76分。为便于实际操作，将复合酒最佳工艺修正为：接种量为0.07%，pH值为3.6，温度为25 ℃，SO2添加量为83 mg/L。平行3次试验，桦树液沙棘复合酒酒精度和感官评分实际值分别为9.61±0.02 %vol和89.79± " 0.40分，与模型的理论预测值接近。因此，该方法对桦树液沙棘复合酒的工艺优化真实可信。
2. 4 优化发酵工艺后桦树液沙棘复合酒的感官评价
根据优化后的发酵工艺制得的桦树液沙棘复合酒澄清透明，呈金黄色，具明显酒香及桦树液、沙棘的清香，香味协调，醇香浓厚。
2. 5 桦树液沙棘复合酒的理化指标和微生物指标检测结果
根据优化后的发酵工艺制得复合酒，其理化指标和微生物检测结果如表5和表6所示，可以看出桦树液沙棘复合酒均满足GB 2758-2012和QB/T 5476-2020的要求。
3 结 论
本试验筛选出适用于桦树液沙棘复合酒酒精发酵的商业菌种为酿酒酵母DV10。根据单因素和响应面试验得到的最佳发酵工艺条件为：酵母接种量为0.07%，pH值为3.6，温度为25 ℃，SO2添加量为83 mg/L。在此条件下制得的桦树液沙棘复合酒酒精度为9.61 %vol，酒体澄清透明，呈金黄色，具有明显的酒香以及桦树液、沙棘的清香，香味协调，醇香浓厚，且其理化指标和微生物指标均符合国家标准。
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