洪坡 ，朱东姿，杨晓宏，王甲威*
(1.山东省果树研究所/农业部黄淮地区果树科学观测试验站，山东泰安 271000；2.泰安市农业农村局)
甜樱桃(PrunusaviumL.)近年来种植面积不断扩大，中国现有甜樱桃栽培面积近20万hm2(300万亩)，是甜樱桃栽培面积最大的国家[1]。但是，由病毒和类病毒引起的甜樱桃病害在中国樱桃主产区均有发生且呈逐年加重趋势，已经成为影响甜樱桃产量和质量的重要因素[2]。笔者从表型、致病病毒及其基因结构、检测方法等方面介绍了樱桃小果病(Little Cherry Disease，LCD)，并提出了防控技术。
1 樱桃小果病的发生及表型樱桃小果病是在甜樱桃和酸樱桃中均有发生的一种复杂而严重的病毒性病害。20世纪30年代初，在加拿大不列颠哥伦比亚省首次发现。病果的主要症状表现为果实变小、棱状突起且果顶变尖、不能成熟、着色不良、果实甜度降低、丧失商品价值等(图1-A，图1-B)。叶片形态也发生改变，表现为皱叶和麻叶表型(图2-A)，夏末和秋季时，病叶表现出特异的红色和铜色(图2-B)。不同品种病树的症状强弱存在差异，但树势均会变弱，并逐步传播到世界上各个樱桃产区[3，4]，多个国家均有报道[5-12]。
2 樱桃小果病毒及其基因结构樱桃小果病的发生与两种病毒的感染相关，分别将其命名为：樱桃小果病毒1和樱桃小果病毒2(Little Cherry Virus 1，2，简写为LChV-1和LChV-2)。对这两种病毒及其不同的分离株进行了分子鉴定[13]发现，LChV-1和LChV-2都属于长线形病毒科(Closteroviridae)，但分属于不同的属；LChV-1为隐症病毒属(Velarivirus)成员之一[14]，LChV-2因其粉蚧传播特性，被划分到葡萄卷叶病毒属(Ampelovirus)[13]。
图1 樱桃小果病毒侵染果实
注：A.樱桃品种Lambert，B.樱桃品种Royal Ann。两图左侧为感染樱桃小果病毒2后的樱桃果实，右侧为健康植株的樱桃果实(引自Tefera A. Mekuria 等[33]，略有改动)。
注：A.感染樱桃小果病毒1导致叶片形态发生变化，出现皱叶和麻叶。中间是健康叶片，两边是感染病毒病叶片。B左侧为健康植株，右侧为感病植株，表现红叶症状。
LChV-1病毒颗粒形状为长弯曲杆状，长度1786～1820nm。对LChV-2病毒颗粒的测量其尺寸为11.2×1667nm[15]。目前已经测定了两种病毒的全基因组序列[13]。通过small RNA测序以及重叠RT-PCR扩增等方法，目前在NCBI数据库中共报道了9个LChV-1分离株的全长基因组和4个LChV-2分离株的全长基因组[13,16-19]。
LChV-1及其不同分离株的基因组全长在16880～16963个核苷酸之间，由于不同分离株间进化关系的不同，其分别包含4～5个外显子和3～4个内含子(图3)。一般包括8个开放阅读框(ORF)，可能分别编码木瓜蛋白酶类蛋白酶(papain-like protease，PPRO)、甲基转移酶(methyltransferase，MET)和解旋酶(helicase，HEL)的保守复制结构域(ORF1a)，RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRp；ORF1b)，一种小的疏水蛋白(smallhydrophobic protein，p4；ORF2)，70kDa的热休克蛋白同系物(heat-shock protein homologue，HSP70；ORF3)，61kDa的多肽(polypeptide，p61；ORF4)，外壳蛋白(coat protein，CP；ORF5)及次要外壳蛋白(CP minor，CPm；ORF6)和两个目前功能未知的21kDa多肽(polypeptides，p21；ORF7)和27kDa 多肽(p27；ORF8)。LChV-2及其不同分离株的基因组全长在15031～15425个核苷酸之间，同样分别包含4～5个外显子和3～4个内含子(图4)。由于同属于长线形病毒科，其序列中存在一组保守的核心蛋白编码序列，包括参与复制[11]以及编码木瓜蛋白酶类蛋白酶(PPRO)、甲基转移酶(MET)、解旋酶(HEL)和RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)等，同样保守的还有病毒外壳蛋白[11]，包括一个小的疏水蛋白、外壳蛋白(CP)、重复被膜蛋白(CPd)和热休克蛋白同系物(HSP70)等[20]。
樱桃小果病的主要致病因子是LChV-2，LChV-1引起的症状较轻。目前发现这两种病毒仅感染李属植物，单独或混合感染都有发现。一般甜樱桃感病后的症状较为严重，某些酸樱桃品种也会出现严重的症状，几种观赏李属植物感染该病后并不表现症状[3]。李、桃和扁桃中都发现了LChV-1的潜隐感染[12]。LChV-1感染可能导致白普贤樱(Shirofugen)[21]和关山樱(Kwanzan)矮化[22]。Jelkmann等人通过RT-PCR检测发现LChV-1和LChV-2均可感染菟丝子(Cuscutaeuropaea)[3]，并且利用菟丝子成功地将这两种病毒传播到西方烟(Nicotiana occidentalis)品种37B上。LChV-2至少可由两个种的粉蚧进行传播，即苹果粉蚧(Phenacoccusaceri)和葡萄粉蚧(Pseudococcusmaritimus)[23]。目前并没有发现LChV-1的昆虫介体。两种病毒都易于嫁接传播，这可能是传播介体缺失或群体较少时这两种病毒的主要传播方式。
3 樱桃小果病的检测方法鉴定樱桃小果病的传统方法为指示植物法，即利用甜樱桃品种Sam或Canindex I[24]作为指示植物进行鉴定，LChV-2分离株能够导致明显的叶部症状，LChV-1导致的症状较弱或没有症状。研究人员通过构建重组蛋白得到了同时检测这两种病毒的抗血清[3]，但该血清仅在加拿大不列颠哥伦比亚省的部分地区的LChV-2检测中使用过；还可以采用RT-PCR(实时荧光定量PCR)法检测这两种病毒，通过开发新的引物，能够更准确的检测这两种病毒[25-28]。但是以上方法均需要对相关病毒的基本信息有一定的了解，对于一些未知病毒受到极大的限制。随着高通量测序技术的不断发展，small RNA测序成为检测植物病毒最有效的方法，能够快速地检测到样品中存在的所有病毒，具有更高的灵敏度和信噪比，并且检测结果不存在假阳性的问题。随着测序成本的不断降低，基于small RNA深度测序技术逐渐成为检测植物病毒最准确、最常用的方法[29]。
4 樱桃小果病的防控对樱桃小果病的防控，主要利用高标准的检疫程序对苗木的生产和交易进行检测。用于樱桃果实生产的重要品种原种圃必须经过严格的检测，确保没有LChV-1和LChV-2感染。如果原种圃植株被这两种病毒感染，可通过组培脱毒，也可结合体外化学药剂处理脱除[30]。樱桃苗木应选择无毒苗，并且随时观察樱桃苗的生长状况，加强对苗圃害虫防治以及杂草清理工作。当苗圃中有粉蚧发生，应及时喷洒杀虫化学药剂进行控制。果园应该制定应对粉蚧发生处置程序，根据粉蚧种群和樱桃小果病的发生情况，采用不同的处理程序。当发现生产园内有疑似感病植株时，应及时向有关专业机构进行咨询，进行专业的病毒检测实验，一旦确定感染樱桃小果病毒，应及时将病树移除，并在生产园内进行昆虫介体的灭杀工作，防止樱桃小果病毒的传播与扩散，从而将生产园的损失将至最低[31]。