刘政，曲淼，杨殿静，王丹萍，李立才，张功
(通化市园艺研究所，吉林通化 134000)
软枣猕猴桃(Actinidiaarguta)果面光滑无毛，果实含有脂肪、氨基酸、多种维生素和微量元素、果胶等营养成分[1]，适合鲜食、加工罐头、果脯等，具有健胃、解热、止血等医疗保健功能，根及根皮对消化道癌症具有一定的抑制和治疗作用[2],发展前景较广[3]，以中国东北三省的野生资源最为丰富。目前多采用常规的种子播种、枝条扦插、嫁接等方式进行繁殖。种子繁殖易产生性状分离，扦插和嫁接繁殖速度慢。
延龙二号是延边大学2008年在吉林省蛟河市漂河镇青背村发现的，属于长白山野生软枣猕猴桃优良单株，自然杂交种。该品种为大果型，平均单果重为19.74 g，果实为扁长方形且具竖棱沟，果实成熟期果皮黄绿色。果肉细腻，高糖和低酸是该品种的最大特点，糖酸比高，口感好。可溶性固形物含量17.5%，可滴定酸含量0.42%，维生素C含量176.7 mg/100 g。果实9月中旬成熟(图1)。笔者以延龙二号品种为材料，研究不同植物生长调节剂类物质诱导愈伤组织的分化，为软枣猕猴桃生理、育种及繁殖研究提供参考。
图1 软枣猕猴桃延龙二号结果状
1 试验材料与方法1.1 试验材料软枣猕猴桃延龙二号茎组培的无菌愈伤组织。诱导培养基为MS+Zt 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+GA3 1.0 mg/L +2,4-D 1.0 mg/L，培养时间40 d。愈伤组织生长分化培养基为基本培养基MS、琼脂4 g/L、糖30 g/L、pH值5.6～5.8。植物生长调节剂类：玉米素Zt(细胞分裂素类)、6-苄氨基腺嘌呤(6-BA，细胞分裂素类)、萘乙酸(NAA，生长素类)、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、赤霉素(GA3)。
1.2 试验设计与方法试验于2019年12月中旬至2020年1月中旬进行。试验设两部分处理(表1)。试验一，筛选适宜愈伤组织生长分化的细胞分裂素类生长调节剂Zt、6-BA的浓度：在基本培养基MS中，分别加入Zt和6-BA各4个浓度(0.5、1.0、2.0、3.0 mg/L)，计8个处理，重复4次。试验二，应用试验一筛选出的Zt和6-BA的适宜浓度(1.0 mg/L)，再以生长素类生长调节剂NAA 6个浓度(0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/L)进行试验，筛选出适宜茎愈伤组织生长分化的植物生长调节剂浓度组合，计12个处理，重复4次。
所有试验在无菌超净工作台上操作。愈伤组织培养基制作，MS加琼脂、糖、植物生长调节剂，混匀，以NaOH调节pH值，置于电磁炉上加热至沸腾，倒入培养瓶中，拧好瓶盖，再置于高压灭菌锅内，121 ℃、灭菌20 min后，培养茎愈伤组织。
表1 试验设计
用镊子从培养瓶中取出茎愈伤组织，在操作盘上，用手术刀去掉茎部分，将愈伤组织接种在新配置的培养瓶内，置于温度25±2 ℃、空气相对湿度40%～50%培养室内，全天光照，光强1 500～2 000 lx。培养10、20、30 d时3次观察愈伤组织的诱导及分化情况，其中愈伤组织生长发育情况以正常生长，无褐化现象发生(或褐化轻且时间晚)，及有芽或根分化为好。
2 结果与分析2.1 Zt和6-BA对软枣猕猴桃茎愈伤组织生长发育的影响由表2可知，MS+Zt培养基较MS+6-BA培养基的愈伤组织褐化轻。MS+6-BA各处理20 d时均有褐化现象，而MS+Zt除0.5 mg/L外其他各浓度无褐变。MS+6-BA 1.0 mg/L和MS+6-BA 2.0 mg/L培养10 d均有根分化，1.0 mg/L 6-BA较2.0 mg/L的愈伤组织褐化时间晚，程度轻。MS+Zt处理中，以MS+Zt 0.5 mg/L 10 d时有芽分化，MS+Zt 1.0 mg/L生长正常，无褐化现象。说明Zt对愈伤组织诱导生长效果好，表现褐化轻且持续生长；6-BA促进酚类物质产生，使愈伤组织出现了不同程度的褐化，但6-BA促进愈伤组织分化根。据已有数据并参考文献，当细胞分裂素浓度为1.0 mg/L时效果较好，表现为褐化时间晚，程度轻，有根分化，分化生长速度快。
表2 Zt和6-BA对软枣猕猴桃茎愈伤组织生长发育的影响
2.2 不同植物生长调节剂组合对软枣猕猴桃茎愈伤组织生长分化的影响如表3，以筛选出的适宜Zt和6-BA浓度1.0 mg/L为基础，分别与6个浓度的NAA(0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/L)组合配制培养基，接种茎愈伤组织后的组培表现为：MS+Zt+NAA处理中，以MS+Zt 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L的茎愈伤组织培养效果为好，表现生长，无褐化。MS+6-BA+NAA处理中，MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L培养10 d愈伤组织有芽分化，但培养20 d时出现褐化现象；MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L，根分化、生长明显，至30 d时愈伤组织才出现褐化现象，但仍继续生长(图2，图3)。
添加NAA后能促进愈伤组织生长，且愈伤组织褐化程度轻，可能NAA对酚类物质有一定的抑制作用。
图2 软枣猕猴桃延龙二号茎愈伤组织生长分化芽情况注：A1、A2、A3为MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L培养基上10 d、20 d、30 d的生长分化情况。
图3 软枣猕猴桃延龙二号茎愈伤组织生长分化根情况注：B1、B2、B3为在MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L培养基上10 d、20 d、30 d的生长分化情况。
3 小结与讨论对延龙二号软枣猕猴桃茎愈伤组织进行培养，在基本培养基MS中，添加不同浓度不同种类的植物生长调节剂对愈伤组织的生长、芽分化、根分化作用不同。在MS中单添加细胞分裂素时，Zt比6-BA褐化程度轻。当MS+Zt 0.5 mg/L培养时，愈伤组织生长10 d时就有芽分化，但20 d时已严重褐化不能继续生长。MS+Zt 1.0 mg/L培养时，愈伤组织变化小，无褐化，至30 d时正常生长。当MS+6-BA 1.0 mg/L、2.0 mg/L时，愈伤组织培养10 d时均有根分化，继续培养时出现褐化现象，但直至30 d时仍能生长、分化根。以MS+6-BA 1.0 mg/L效果好，只有部分褐化。所以在MS中单添加细胞分裂素Zt、6-BA时，都以浓度1.0 mg/L培养时效果为好。茎愈伤组织于MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L上培养10 d时有芽分化。在MS+6-BA 1.0 mg/L +NAA 0.2 mg/L上培养10 d时根系明显生长，且有次生根生长。故认为MS+6-BA 1.0 mg/L +NAA 0.2 mg/L培养效果最好，褐化晚且轻，有根分化。
在MS添加细胞分裂素Zt、6-BA浓度都为1.0 mg/L基础上，再添加不同浓度的生长素NAA时，发现愈伤组织褐变程度有所减轻。笔者在软枣猕猴桃魁绿、绿王品种上试验有同样结果。这与Matkow等人[4]研究结果一致。细胞分裂素刺激酚类产生而发生褐变，生长素NAA能够延缓多酚合成，减轻褐变。刘小刚等[5]也有生长素NAA可以防止愈伤组织继代中的褐变的研究结论。
外植体来源不同，内源激素水平也不同，培养基中所含生长调节剂浓度不同时，导致来源不同的外植体在分化能力等方面存有差异[6,7]。刘延吉等[8]研究发现，野生软枣猕猴桃H1在6-BA、NAA浓度分别为1.0 mg/L、0.2 mg/L时分化率、增殖系数、成活率最高，适宜扩繁。朴一龙等[9]研究发现，用MS+6-BA 1.0 mg/L +NAA 0.2 mg/L和MS+6-BA 1.0 mg/L +NAA 0.5 mg/L做培养基诱导产生不定芽，芽分化率达95.83%，新芽形成30 d左右，长度3 cm时宜转接继代培养基MS+Zt 2.0 mg/L +NAA 0.2 mg/L +GA3 1.0 mg/L培养。